Birrefringências

Retardo óptico (RO) devido à birrefringência (B), a birrefringênica do colágeno é expressa pela diferença dos dois índices de refração;
B = n_e– n_o , onde n_e é o índice de refração do raio extraordinário (no caso das fibras de colágeno é a direção paralela ao eixo da fibra, n_o é o índice de refração do raio ordinário, cuja direção de propagação é perpendicular ao eixo da fibra (índices de refração são causados pela polarizabilidade dos electrons). Uma frente fotônica polarizada propaga-se no interior de uma amostra birrefringente biaxial em direções perpendiculares que ao emergirem do objeto com uma diferença de fase, entram, então em interação interferencial, do que resulta o brilho visível da birrefringência. Este brilho corresponde ao retardo óptico OR = (n_e– n_o) .e ou B.e (onde, e = espessura). Ou seja, o RO varia com a espessura dos corte ou a concentração de material. Já, a birrefringência textural ou de forma expressa-se pela simples equação BT = n_e² – n_o² (considere-se que n² = ε,  detalhes adiante).

Para uma proteína sem cor visível, a principal contribuição para o índice de refração e/ou o RO na passagem da luz é dada pela transição π – π^* da ligação peptídica planar que liga os amino-ácidos. Para a luz polarizada visível e infravermelha próxima paralela à transição do dipolo, cerca de 150° do eixo N – C no plano N–C=O, o RO destas ligações é proporcional à sua densidade por superfície.
RO =S. e²/ 2ε_omω02 = Sx2.510^-15 pm.

S e´o número de ligações peptídicas/cm² e, m são a carga e a massa do eléctron, ε_o é a permitividade (constante dielétrica) do espaço e ω_o é a ressonância da frequência deste oscilador electrônico (Landowne, 1985; Cantor and Schimmel, 1980). Em suma, a birrefringência intrinseca ou cristalina é determinada pela orientação e força (potência) de todas as transições de eléctrons das moléculas que compõem o filamento.

Birrefringência textural (B_T), de forma, (algumas vezes também chamada de estrutural) depende da geometria das moléculas, de que estas sejam menores ou iguais ao comprimento de onda usado na análise, da diferença de seus índices de refração com respeito ao seu meio, ou ao índice de outras moléculas que componham um corpo misto, e da fração proporcional com que entrem na composição do objeto (no caso, considere-se a CT como um compósito) e das distâncias que as separe, também equivale a dizer que seja compatível com os comprimentos de onda. Lembre-se que a molécula de colágeno é nanométrica, anisodiamétrica e quiral; detalhes em Vidal (1980; 1986, 2003b). Neste ponto, será útil dizer que o exposto até aqui mostra que as fibras de colágeno têm uma anisotropia de constantes dielétricas (ε = n²) também exibem uma periodicidade microscópica (ou seja, teriam propriedades fotônicas, Vidal, 2003a).

Na atualidade, os estudos e aplicações de estruturas que têm BT assumem muita relevância, vejam-se os trabalhos que procuram construir estruturas até metálicas cujos princípios arquiteturais obedecem às caracteristicas e propriedades aqui descritas, (Tsai et al.2006)

As bases para este conhecimento foram estabelecidas desde 1912, leia-se em Schmidt, 1937, Schmidt e Keil, 1958,“ Formdoppelbrechung wird, nach Wiener (1912), erzeugt durch einen Mischkörper , der aus zwei geordeneten Komponenten besteht , die anysodiametrische Form und verschiedene Brechzahl besitzen und derem Durchmesser und Abstände (wenigstens in einer Dimension) klein sind im Vergleich zur Lichtwellenlänge sind.” É importante trazer-se a tona que CT e tendões são estruturas complexas com mais de dois componentes.

Detalhes encontram-se nos estudos detalhados de curvas de birrefringência de forma permitiram estabelecer diferenças entre tendões, colágeno tipo I, de cartilagens, colágeno tipo II (Vidal, 1977; Vidal e Vilarta, 1988) sendo que tal gênero de estudos é confirmado por pesquisas atuais (citando escola de Vidal) usando “polarization-sensitivite optical coherence tomography” (OS-OCT) (Park et al. 2006).

Dicroismo Linear (DL)

O dicroísmo linear (DL) é a anisotropia óptica devida a absorbância seletiva da luz polarizada por grupos cromofóricos orientados, fornece informações precisas e simples de transições eletrônicas dos elétrons de grupos cromofóricos orientados, de acordo com Nordén, 1978, “..the absorption being maximum when the light vector is polarized parallel to the transition moment and zero when perpendicular to it”. DL, pode, então, fornecer : 1- “directions of transition moments when the molecule orientation is known, ie. Spectroscopic application” ou 2- “information of molecule orientation when the transition moments are known, i.e. structural application”. Nas próprias afirmações de Nordén, 1978: “Linear dichroism is related in a very simple way to well separated quantal transitions while birefringence is a complicated average over all transitions in the molecule” Em realidade, birrefringência e DL contêm as mesmas informações básicas e estão relacionadas por equações de dispersão (Vê-se desde logo que a birrefringência tem um caráter estatístico).

No caso específico do colágeno, não há DL na amplitude dos comprimentos de onda visíveis, somente no ultravioleta ? em torno de 200 – 220 nm, pelos eléctorns p – p* da ligação peptídica planar que liga os amino-ácidos (as mesmas que originam a Birrefringência). Assim, para obter-se o fenômeno usa-se de um evento extrínsico ao colágeno complexando-o com corante azoicos sulfonados dicroicos (Vidal, 1970, 1980, Vidal e Mello, 2005). A complexação de Ponceau SS (que também é fluorescente) com feixes de colágeno gera uma estrutura supramolecular dotada de capacidade de polarizar uma frente de onda (Vidal e Mello, 2005), fenômeno que será relevante na avaliação da ordem molecular e seu reflexo nas propriedades físicas das CT. Detalhes sobre as medidas e expressões matemáticas sobre DL serão apresentadas em Material e Métodos.

Os detalhes citados aqui para enfatizar que estas propriedades ópticas estão de acordo com o estado da arte no campo da óptica não linear e da fotônica, nas pesquisas modernas (detalhes na futura Discussão), e que birrefringências e determinação de ordem molecular são objeto de milhares de publicações especialmente no campo das ciências dos materiais (dados comprobatórios desta afirmação podem ser obtidos entrando-se no PubMed ou Web of Science usando os título: “birefringence e dichroism ou linear dichroism”).

A Birrefringência de Forma na Atualidade e a minha Contribuição
Benedicto de Campos Vidal

O foco da exposição é o fenômeno óptico conhecido como Birrefringência de Forma ou textural que vem sendo atualmente objeto de extensivos estudos na física moderna. Pois bem, antecedi-me a estes estudos, na sistematização de sua prática e em suas aplicações biomédicas. A leitura de um resumo que devo apresentar em Congressos a serem realizados proximamente, é aconselhável.

O propósito da seguinte exposição de idéias e fatos é simplesmente mostrar que os meus trabalhos e seu ineditismo não se confinaram no espaço–tempo mas estenderam-se por 43 anos. Hoje, apesar dos meus 83 anos e de ser Prof. Emérito e ser citado mais de 900 vezes, não descanso e com satisfação colho os frutos de uma atividade inédita, continuada, não só no Brasil.

A birrefringência de forma é uma das propriedades anisotrópicas ópticas, ela depende (é originada em) de estruturas nas quais pelo menos um dos componentes tenha dimensões menores (compatíveis com) do que comprimento de onda usado no estudo, é necessário que a estrutura tenha periodicidade e que haja um arranjo ordenado de seus componentes.

A colocação das pesquisas sobre a Birrefringência de Forma         (∆_F = n_e² – n_o²; n² = € ) dentro de um contexto científico amplo obedecerá aos seguintes tópicos:
1- Conexões dentro do campo da física aplicada. Referências recomendadas em anexo.
2 - Conexões no campo abrangente de problemas. Biomédicos,minha contribuição.
3 - Desenvolvimentos em nanotecnologia para uso futuro inspirados em estruturas ricas em colágeno do Tipo I. Desenvolvimento futuro para aplicações biomédicas.
1 -Um dos aspectos até práticos sobre a nanotecnologia vem sendo o foco da física contemporânea na birrefringência de forma (∆_F).

Estruturas fundamentadas em ∆_F para uso em optoelectrônica ou estruturas ópticas integradas (“Integrated Optical devices”) são exemplos encontrados na literatura especializada. Filmes porosos de sílica vêm sendo produzidos com alguns propósitos, realizando uma nanogravação em vidro de sílica usando um modelo de BT, tal que seja produzida uma nanozona periódica dotada de alta birreringência de forma, ∆_F de filmes porosos de sílica são produzidos por evaporação adequada tal que possam criar ou planejar estruturas ópticas para aplicações específicas. Efeitos óptico-eletrônicos são obtidos com a produção desses filmes para serem usados v.g. em comunicação. BT tem sido estudada e aplicada até em ferrofluidos.

Exemplo muito expressivo é a construção de uma micro-engrenagem construída sobre os princípios da ∆_F. A ∆_F produz um momento fotônico que movimenta a micro-engrenagem.

Cristais fotônicos com ∆_F também são citados como sensores multiparamétricos. A modulação precisa em fibras ópticas cristalinas depende de ∆_F.

2- No campo das conexões no terreno biomédico devo, por razões históricas, fixar-me exatamente nas minhas contribuições que têm sido consideradas pioneiras por autores fora do nosso país.

Com a publicação feita em 1965 introduzi o uso sistemático de meios de embebição, imersão, baseado em H2O, soluções aquosas de glicerina e glicerina PA, óleos minerais especiais, inertes, para estudo de BT a fresco (sem qualquer tratamento prévio) de feixes de colágeno. Esta publicação serviu de base para estudo quantitativos de geração de segunda harmônica (“SHG de second harmonic generation) de feixes de colágeno) resultados dessas pesquisas foram feitas em 1981 e 1982, i.e. 17 e 18 anos após a minha publicação [Roth & Freund, Biopolymers 20: 1271 – 1290 (1981) Roth & Freund, J. Appl. Cryst. 15: 71 – 78, (1982)]. Tais achados comprovaram a não linearidade óptica dos feixes de colágeno. Até o presente temos continuada e historicamente publicado e orientado trabalhos, com ineditismo, sobre birrefringência de forma. Segue uma lista das principais publicações:
Vidal, B.C., 1965. The part played by the mucopolysacharides in the form birefringence of collagen” Protoplasma 59, 472 – 479.

B.C. Vidal. 1977. Acid glycosaminoglycans and endochondral ossification: microspectrophotometric evaluation and macromolecular orientation. Cell. mol. Biol. 22: 45 – 64.

Pela primeira vez se mostra pela birrefringência de forma as diferenças de anisotropia entre colágeno tipo I e tipo II, entre outra contribuições importantes sobe a birrefringência de forma.

Mello, M.L.S. and Vidal, B.C. 1972. Evaluation of dichroism and anomalous dispersion of the birefringence on collagen subjected to metal impregnations. Ann. Histochim. 17: 333 – 340.

Vidal, B.C., Mello, M.L.S., Godo, C., Caseiro F°, A.C. and Abujadi, J.M. 1975. Anisotropic properties of silver plus gold-impregnated collagen bundles: ADB and birefringence curves. An. Histochim. 20: 15-26. Neste trabalho, pelos calculos de birrefringência de forma e da dispersão anômala da birrefringência (ADB que é uma óptica não linear), foi possível propor a distribuição dos cristalitos de Ag, ordenadamente arranjado nas fibras de colágeno. Abaixo é citado o trabalho feito com TEM mostrando o tamanho nano- métrico da Ag. É importante citar que os três últimos co-autores eram alunos do primeiro ano da FCM-Unicamp que, como estagiários, tomaram parte e aprenderam a importância das técnicas e o seu conteúdo teórico para uso em diagnóstico.

B.C. Vidal and J. Joazeiro. 2002. electron microscopic determination of silver incorporation in collagen fibers as a model of organic-metal chiral supramolecular structure with optical anisotropic properties. Microm 33: 507 – 509. Este trabalho super inédito conecta-se com o anteriormente citado Vidal et al. 1975.
Os trabalhos sobre prata (Vidal et al. 1975 e Vidal & Joazeiro, 2002, foram citados agora - 2007 com detalhes confirmando nossos achados.

B.C. VIDAL, 2003. Image analysis of linear dichroism in collagen-nano-silver complexes. Microscopy and Analysis (UK), pp.21-23. Este trabalho completa o ciclo sobre a complexação de Ag. Com colágeno e permitiu a conclusão de que o complexo tem propriedades ópticas não lineares e fotônicas. O que para estruturas biológicas é inédito.

As citações concernentes a Ag não obedeceram uma ordem cronológica, como foi o sentido geral, pois a intenção foi mostrar suas conexões.
Vidal, B.C. 1980. The part played by the proteoglycans and structural glycoproteinsin the macromolecular orientation of collagen bundles. Cell. mol. Biol. 26: 415 – 421.
VIDAL, B.C., 1986. Evaluation of carbohydrate role in the molecular order of collagen bundles: microphotometric measurements of textural birefringence. Cell. Mol. Biol. 32: 527–535. Estes dois trabalhos estudam pormenorizadamente o fenômeno de birrefringência de forma e suas aplicações aos problemas de ordem molecular e estado agregacional em feixes de colágeno. Traz também uma contribuição metodológica.

B.C. Vidal and R. Vilarta. 1988. Articular cartilage: Collagen II – proteoglycan interactions. Availability of reactive groups. Variations in birefringence and differencesas compared to collagen I, Acta Histochem. 83: 1898 – 205.
Vilarta, R. and Vidal, B.C. 1989. Anisotropic and biomechamical properties properties modified by execise and denervations: Aggregation and macromolecular order in collagen bundles. Matrix 9: 55 -61. É um trabalho muito citado, seu título diz tudo. [Vasanthan (Appl. Spectrosc. 59: 897 – 903 (2005) usou a determinação da orientação molecular em fibras de poliamida submetidas a tensão, medidas por meio de birrefringência comparadas com difração de RX, bom foi a birrefringência].

B.C. Vidal. 2003. Image analysis of tendon helical superstructure using interference and polarized light microscopy. Micron 34; 423 – 432. Aquí é diagnosticado um tendão como um objeto quiral, e como um cristal líquido tipo TGB, ou seja Twisted Grain Boundary. O trabalho vem sendo bem citado.

Ribeiro J.F; dos Anjos E.H.M; Mello M.L.S; Vidal, B.C. 2013. Skin collagen fibers molecular order: a pattern of distributional fiber orientation as assessed by optical anisotropy and image analysis. http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0054724

Recentemente tenho trabalhos recém publicados nesta área, aceito para publicação e ainda outros sob a análise de assessores, em revistas internacionais com índice de impacto de 2,8 a 1,34.

Não estão citados aqui, com detalhes, os estudos de birrefringência de forma de queratinas e de celulose.

3 - Também não estão levadas em consideração, aqui, as minhas contribuições específicas na linha de colágeno e de suas aplicações em medicina.

Antevejo aplicações importantes para os estudos nessa linha de pesquisas. Estrutura de feixes de colágeno do tipo I como inspiração para construção de estruturas com birefringência de forma.

Dar continuidade às observações que já fiz de que colágeno cristalizado conduz luz de laser como se fosse fibra de vidro.

Aplicação de laser terapêutico, mas plenamente polarizado.

Em aplicações médicas, relacionar a estrutura com ordem molecular para obtenção de melhores efeitos. Já defendida uma tese de doutoramento prova a efetividade do laser polarizado em induzir efeitos notáveis em estruturas nas quais compatibilizou-se orientação molecular do tecido com o vetor elétrico do lazer polarizado (Tese orientada por Marta ribeiro e por mim).

Com respeito à córnea os estudos sobre as sua propriedades ópticas tenho orientado e participado ativa e teóricamente e teórica em trabalhos que já geraram publicações em revistas de impacto internacional, assim, sobre córnea humana figurão como o último autor em trabalho publicado na Molecular Vision v. 13: 142 – 150 (2007), índice de impacto 2,239. O trabalho sobre a influência do diabetes está aceito e no prelo na Vision, impacto 4.

Por convite, aceitamos publicar no livro Biopolimers, a ser editado nos EEUU, dois capítulos sobre os temas de propriedades anisotrópicas ópticas em córnea e em tendões que são produto de desenvolvimento de teses já defendidas.

As figuras a seguir ilustram a potencialidade da análise de polímeros e biopolímeros, com microscopia de polarização.